Faculté des Sciences Ain Chock Casablanca

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THESE DE DOCTORAT

Présentée par

Mme Latifa FOURRAT

Contribution à l’étude des glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogènases: effet du stress oxydatif et nitrosatif chez des espèces eucaryotiques et mise en évidence d’une nouvelle enzyme procaryotique.

 

Professeur Pr. Abdelaziz SOUKRI Encadrant
UFR: Biologie et Santé
Date d’accréditation : 2005 / 2008


Soutenance : Le Lundi 17 mars 2008, à 15h devant le jury constitué de :

Pr. H. AZEDDOUG

Professeur, Faculté des Sciences Aïn Chock, Casablanca

Examinateur, Président

Pr. O. ASSOBHEI

Professeur, Faculté des Sciences, El Jadida

Examinateur

Pr. R. CADI 

Professeur, Faculté des Sciences Aïn Chock, Casablanca

Rapporteur, Examinateur

Pr. R. SAILE 

Professeur, Faculté des Sciences Ben M’sik, Casablanca

Rapporteur, Examinateur

Pr. B. NASSER  

Professeur, Faculté des Sciences et Techniques, Settat

Rapporteur, Examinateur

Pr. A. SOUKRI   

Professeur, Faculté des Sciences Aïn Chock, Casablanca

Directeur de thèse


Résumé:
Dans la première partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à l’effet des radicaux libres sur le métabolisme cellulaire chez des eucaryotes. En premier lieu, le protozoaire cilié Tetrahymena  pyriformis a été choisi comme modèle eucaryotique pour étudier l’effet du peroxyde d'hydrogène et du sodium nitroprusside (donneur de NO·) sur la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogènase (GAPDH). Les deux réactifs ont inhibé la croissance et ont induit une augmentation spécifique de la production de la GAPDH mais seulement NO· a réduit son activité dans les extraits cellulaires. L'activité spécifique et le pI semblent être affectés chez l’enzyme purifiée traitée par NO· mais aucun effet n'a été détecté après le traitement in vivo par H2O2. Les résultats de la chromatofocalisation analytique de l’enzyme purifiée suggèrent une modification post-translationnelle de l'enzyme par NO·. Néanmoins, pour l’effet in vitro après purification de l’enzyme à partir des cellules non traitées, une baisse d'activité de la GAPDH causée par le H2O2 et le NO· a été observée. Elle est due à une baisse de son Vmax sans changement apparent de l’affinité du substrat. L'augmentation du niveau d’expression de la GAPDH observée in vivo suggère une réponse de la cellule pour compenser l'effet inhibiteur  observé sur l'enzyme purifiée.
En deuxième lieu, l’adaptation des deux levures Yarrowia lipolytica et Pichia pastoris au stress oxydatif et nitrosatif induit par le peroxyde d’hydrogène, le sodium nitroprusside et le ménadione a été étudiée. Cette étude à montré que ces composés affectent la viabilité des deux levures, en causant des dommages cellulaires tel que la peroxydation lipidique. Une inactivation de la GAPDH a été également observée in vivo et in vitro chez ces mêmes cellules. En revanche, les enzymes impliquées dans le système de défense anti-oxydatif tel que la catalase, la glutathion peroxydase et la superoxyde dismutase ont été induites simultanément chez les cellules traitées. La Pré-induction de ces enzymes par traitement des cellules avec de faibles doses d'oxydant, leurs a permis de tolérer de plus grandes doses du composé.
D’un autre coté, la deuxième partie concerne la recherche d’une nouvelle activité non  phosphorylante de la GAPDH chez la bactérie à Gram- Neisseria meningitidis. L’alignement des séquences d’acides aminés des glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogènases non  phosphorylantes (GAPNs) et aldéhyde déshydrogènases (ALDHs) d’espèces d’eucaryotes, archéobactéries et bactéries avec la séquence d’une enzyme GAPN putative présente dans le génome de N. meningitidis a montré une conservation des résidus impliqués dans l'activité catalytique. La séquence prédite du gène gapN de N. meningitidis a été clonée chez Escherichia coli XL1-Blue sous l'expression d'un promoteur inductible. La GAPN induite par l’IPTG a été purifiée et caractérisée; la protéine est un homotétramère, présentant une spécificité absolue pour le NAD et utilisant un spectre général de substrats aldéhydes. Les données phylogénétiques suggèrent que la GAPN de N. meningitidis a un rapport plus proche avec les GAPNs et ALDHs d’archéobactéries qu'avec les GAPNs NADP-dépendantes typiques des bactéries Gram+ et des eucaryotes photosynthétiques.

Mots clés : métabolisme central du carbone, glycolyse, glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase phosphorylante (GAPDH) et non-phosphorylante (GAPN), NAD(P)-dépendance, superfamille des Aldéhydes déshydrogénases, stress oxydatif et nitrosatif, peroxydation lipidique, système antioxydant,  levures, Neisseria meningitidis.
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